## RFL-6大鼠成纤维细胞培养指南

### 一、细胞培养条件

细胞名称：RFL-6大鼠成纤维细胞

生长特性：贴壁生长

冻存条件：使用无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：DMEM+10% FBS+1%双抗

传代方法：首次建议1:2传代

传代情况：每两天更换培养液

备注：建议将收集好的培养基留作对比培养，如对比效果不佳，建议选择尊龙凯时的完全培养基。

### 二、细胞处理步骤

在收到细胞后，应培养至良好状态，再用完全培养液灌满并密封瓶口，这是运输细胞的最佳方式。收到细胞后，需用75%酒精消毒瓶身，然后在超净工作台上进行严格的无菌操作。将细胞瓶置入37℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态再进行后续处理。通过显微镜观察细胞生长情况，并对不同倍数的细胞状态拍照保存（最好分别拍摄40x, 100x, 200x的照片），前三天的照片将作为重要的售后依据，如未提供照片将默认细胞状态良好。注意在培养箱中放置时需松开瓶盖，进行传代时建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基以便对比培养。

### 三、细胞培养步骤

a. 细胞传代：若细胞汇合度未超过80%，则收集培养液至离心管，保留5ml完全培养基，并放入37℃、5% CO2孵箱培养；若细胞密度超过80%，可进行传代，具体步骤如下：

1. 丢弃培养上清，用不含钙、镁的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，在37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态，如细胞大部分变圆脱落，迅速停止消化，加入5ml以上完全培养基。
3. 轻轻吹打细胞使之脱落，吸出悬液，转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞按1:2比例分瓶传代，补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。

b. 细胞冻存：细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，按以下步骤操作：

1. 弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS洗涤细胞一次。
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞状态，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃上清，沉淀细胞后加入1ml的尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若后续需转入液氮罐，需在-80℃存放24小时以上再进行转移。

c. 细胞复苏：

1. 从液氮中取出细胞冻存管，快速置于37℃水浴中解冻，直至冻存管无结晶，再用75%酒精擦拭外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃上清，使用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶中，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天更换为新鲜完全培养基继续培养。

### 四、注意事项

在运输过程中，部分细胞可能会脱落，这是正常现象。若脱落较多，可将培养瓶中的培养液收集至离心管，1000 RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养；然后加入胰酶1-2ml，轻轻吹打后消化1-2分钟，加入5ml完全培养基终止反应，再离心，弃上清，重悬后按1:2比例分瓶传代。

### 五、售后条款

1）可重发的情况：

1. 运输过程中如遇细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等情况可重发；
2. 如收到产品48小时内出现污染，请提供真实实验结果，核实后可重发；
3. 常温发货细胞若静置24小时后，干冰冻存细胞复苏后24小时内大部分未存活且提供真实照片，亦可重发；
4. 干冰冻存发货的细胞复苏后或常温发货的细胞静置后出现污染可重发；
5. 如收到产品7天内出现细胞活性问题，请提供真实实验结果通过青苯鉴定后核实重发；
6. 在收到细胞当天及第2至第3天拍照，若三天内未告知，视为产品合格。
7. 若在4-7天内出现问题的，需提供前3天照片和问题时的照片以及相关操作详细步骤，并与技术人员沟通确认责任，后可重发。

2）不予重发的情况：

1. 客户造成细胞污染、不予重发；
2. 不正确操作致细胞状态不佳、不予重发；
3. 使用非本库推荐培养体系导致的问题、不予重发；
4. 细胞状态不佳且未提供前3天照片、不予重发；
5. 细胞在培养过程中经其它处理，不予重发；
6. 收到细胞后2天内未及时告知问题、不予重发；
7. 其他需视具体情况而定。