尊龙凯时大鼠肺泡上皮细胞L2培养说明书

一、细胞培养条件

细胞名称：大鼠肺泡上皮细胞L2

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：1640 + 10% FBS + 1% 双抗

传代方法：首次建议采用1:2比例进行传代，传代情况为每2天更换培养液。

备注：请使用无菌离心管收集培养基瓶，留作对比培养。如果对比培养效果不佳，建议直接购买尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞处理流程

收到细胞后，将其培养至良好状态，灌满完全培养液并密封瓶口，这是运输细胞的最佳方法。收到细胞后，请用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后放入超净工作台，严格进行无菌操作。将细胞瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续处理。请在显微镜下观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片进行保存（建议拍摄40x、100x、200x，各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，如未提供照片则默认收到状态良好。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

在细胞汇合度未超过80%时，将完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基放入37℃、5% CO2孵箱培养。如果细胞密度超过80%，即可进行传代。具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞消化情况；若细胞大部分变圆并脱落，迅速轻敲培养瓶后加5ml完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞以确保完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清液，并用1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 将重悬液按1:2比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，待细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，转移至15ml离心管并在1000RPM下离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀的细胞加入1ml的尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4. 将冻存的细胞直接放入-80℃冰箱中。如果后期需要转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时后再转入液氮罐。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护装备），迅速将其放入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至5ml完全培养基的15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟。
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶中，放置于37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天，换用新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项

有些细胞贴壁不牢，运输过程中可能会脱落，这属于正常现象。可按照以下方法操作：将培养瓶中的所有培养液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，收集上清以便于后续对比培养，沉淀加入胰酶1-2ml，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应。随后再离心，弃去上清并加1-2ml完全培养基重悬。按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，并放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

五、售后条款

1）细胞出现问题，可重发的情况

依据的判定标准包括：

1. 细胞在运输途中遭遇各种问题，如细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，均可重发。
2. 细胞污染问题需在收到产品48小时内反馈真实实验结果，经核实后可重发。
3. 常温发货的细胞，如在静置24小时后，干冰冻存发货的细胞复苏后24小时内若绝大多数细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片），同样可重发。
4. 如干冰冻存发货的细胞在复苏后24小时内或常温发货的细胞静置4小时后未开封且出现污染，均可重发。
5. 细胞活性问题需在收到产品7天内反馈真实实验结果，并用台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后予以重发。
6. 收到细胞当天以及第2、3天请务必拍照，若3天内未告知状态，将视为产品合格。
7. 如在4-7天内出现问题，并提供前三天的照片以及出现问题时的照片和操作详细步骤并与技术人员沟通，由技术人员判定为我方责任的，可重发。若技术人员判定为双方承担责任，则双方协商处理或按合同价的50%收费重发。

2）细胞出现问题，不予重发的情况

1. 客户因自身原因造成的细胞污染，不予重发。
2. 客户不正确操作导致细胞状态不良，不予重发。
3. 非本库推荐的细胞培养体系导致细胞状态不良，不予重发。
4. 细胞状态不佳且未提供细胞培养前3天照片的，不予重发。
5. 细胞培养时有其他处理的，不予重发。
6. 细胞收到后两天内未告知的，不予重发。
7. 视具体情况而定。